恩諾沙星-過氧化物酶標(biāo)記物的制備方法主要有以下幾種：

戊二醛法

• 原理：戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑，能與過氧化物酶和恩諾沙星的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的標(biāo)記物。

• 操作步驟：

• 將恩諾沙星和過氧化物酶分別溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，如0.01mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液。

• 按一定比例混合恩諾沙星和過氧化物酶溶液，加入適量的戊二醛，使戊二醛的終濃度為0.1%-0.5%。

• 室溫下攪拌反應(yīng)2-4小時(shí)，或4℃過夜。

• 反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋對0.01mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液透析，去除未反應(yīng)的戊二醛和其他小分子雜質(zhì)。

• 透析后的標(biāo)記物可加入適量的甘油，分裝后于-20℃保存。

過碘酸鈉法

• 原理：過碘酸鈉可將過氧化物酶的糖基氧化成醛基，醛基與恩諾沙星的氨基結(jié)合形成Schiff氏堿，再用硼氫化na還原穩(wěn)定。

• 操作步驟：

• 溶解過氧化物酶于0.1mol/L NaHCO3溶液中，加入新配制的0.1mol/L NaIO4溶液，室溫避光反應(yīng)20-30分鐘。

• 反應(yīng)后的溶液裝入透析袋，對0.001mol/L pH 4.0的醋酸緩沖液透析過夜，期間更換透析液幾次。

• 將恩諾沙星用0.01mol/L碳酸緩沖液稀釋至一定濃度，并用0.01mol/L碳酸緩沖液將活化好的過氧化物酶溶液pH調(diào)至9.5左右。

• 將恩諾沙星溶液加入過氧化物酶溶液中，室溫或4℃反應(yīng)2小時(shí)。

• 加入新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，室溫作用30分鐘，再加入適量NaBH4溶液，室溫或4℃過夜。

• 最后對0.01mol/L PBS透析過夜，加入保存液于-20℃保存。

改良過碘酸鹽氧化法

• 原理：與過碘酸鈉法類似，也是通過過碘酸鹽氧化過氧化物酶，使其產(chǎn)生醛基，然后與恩諾沙星的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的標(biāo)記物。

• 操作步驟：

• 溶解過氧化物酶于超純水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸鈉，室溫或4℃冰箱反應(yīng)20-30分鐘。

• 反應(yīng)完后裝入透析袋，對0.001mol/L pH 4.0的醋酸緩沖液透析過夜，期間更換透析液幾次。

• 將恩諾沙星用0.01mol/L碳酸緩沖液稀釋至一定濃度，并用0.01mol/L碳酸緩沖液將活化好的過氧化物酶溶液pH調(diào)至9.5左右。

• 將恩諾沙星溶液加入過氧化物酶溶液中，室溫或4℃反應(yīng)2小時(shí)。

• 加入新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，室溫作用30分鐘，再加入適量NaBH4溶液，室溫或4℃過夜。

• 最后對0.01mol/L PBS透析過夜，加入保存液于-20℃保存。

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